شایان نود

چکیده 

دسفری اکسامینB،‌ تنها سیدروفوری است که فرم مزتیله آن (نمک متان سولفونات دسفری اکسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته کردن بار اضافی آهن، استفاده می گردد.

به همین منظور جهت تولید دسفری اکسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط کشت Soy bean کشت داده شد و دسفری اکسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- کلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیکی و افزایش بهره برداری از محصول مذکور از منابع کربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یک بر میزان دسفری اکسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید که اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار %125/0 ترئونین، در محیط کشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B₁)بررسی گردید و مشاهده شد که تاثیر مثبت بر دسفر اکسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اکسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B₁) قرار می گیرد.

در ایـن تحقـیق از شلاته کننـده های کاتیونی EDTA، 8-hydroxyquinoline  در محـیط کشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید که شلاته کننده های مذکور اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین  دارند در نتیجه، کاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر

CaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O,ZnSO₄.7H₂O, MnCl₂, FeSO₄.7H₂O

و همچنین  اثرCaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O به طور همزمان در محیط کشت Soy bean بررسی گردید.

در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری که کلسیم (بصورت CaCl₂.2H₂O) اثر قابل ملاحظه‌ای بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار 8/2، و 2، CaCl₂.2H₂O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذکور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت کلسیم، بر تولید دسفری اکسامین مشخص گردید.

در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اکسامین تولیدی آشکار گردید بطوری که غلظت  ^2-10 × 4/0، ZnSO₄.7H₂O و  6/0، MgSO₄.7H₂O و  2، MnCl₂ سبب افزایش تولید دسفری اکسامین شد.

فهرست مطالب

 

عنوان                                                                                                               صفحه

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………. 1

مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………….. 3

فصل اول

1-1 – تالاسمی……………………………………………………………………………………………………………… 8

1-2-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی……………………………………………………………………………….. 8

1-2-1 – خون شناسی…………………………………………………………………………………………………….. 9

1-2-2- خون سازی و گلبولهای قرمز……………………………………………………………………………….. 10

1-3- تالاسمی و انواع آن………………………………………………………………………………………………. 10

1-3-1 آلفا تالاسمی……………………………………………………………………………………………………… 10

1-3-2- بتا تالاسمی……………………………………………………………………………………………………… 11

1-3-2-1 بتا تالاسمی مینور(سالم ناقل)……………………………………………………………………………… 11

1-3-2-2 – بتا تالاسمی ماژور( بیماری تالاسمی)………………………………………………………………… 12

1-3-2-3-بتا تالاسمی بینابینی…………………………………………………………………………………………. 13

1-4- تشخیص تالاسمی………………………………………………………………………………………………… 13

1-5- درمان تالاسمی…………………………………………………………………………………………………….. 13

1-6- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان…………………………………………………………. 14

1-6-1- مسمومیت حاد آهنی………………………………………………………………………………………….. 15

1-7- دسفرال……………………………………………………………………………………………………………… 16

1-7-1- نحوه استفاده از داروی دسفرال…………………………………………………………………………….. 17

1-7-2-کاربردهای داروی دسفرال در پزشکی…………………………………………………………………….. 18

1-7-3- عوارض ناشی از داروی دسفرال…………………………………………………………………………… 19

1-7-4- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال……………………………………………………………….. 19

1-7-5- ملاک توقف درمان بوسیله دسفرال………………………………………………………………………… 20

فصل دوم

2-1-  سیدرو فورها……………………………………………………………………………………………………… 22

2-1-1- هیدروکسامات ها……………………………………………………………………………………………… 24

2-1-2-فنولات ها یا کاتکولات ها……………………………………………………………………………………. 25

2-2- دسفری اکسامین ها………………………………………………………………………………………………. 26

2- 2-1 – ساختمان دسفری اکسامین………………………………………………………………………………… 28

2-2-2- دسفراکسامین بصورت آنتی اکسیدان……………………………………………………………………… 28

2-2-3 – خصوصیات فیزیکو و شیمیایی دسفراکسامین…………………………………………………………. 29

2-2-4- مکانیسم دسفراکسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن………………………………. 29

2-2-5- تشکیل رادیکال  DFO nitroxide…………………………………………………………………….. 30

2-3-  دسفری اکسامین B……………………………………………………………………………………………… 31

2-3-1- بیوسنتر دسفری اکسامین B…………………………………………………………………………………. 33

2-3-2- ژنهای کد کننده دسفری اکسامین B………………………………………………………………………. 33

2-4- تولید کننده­های دسفری اکسامین………………………………………………………………………………. 34

2-5- اهمیت آهن بر روی میکروارگانیسمها……………………………………………………………………….. 35

2-6- مکانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میکروارگانیسمها………………. 36

2-7- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اکسامین B…………………………………………………………….. 37

فصل سوم

3-1- اکتینومیست ها…………………………………………………………………………………………………….. 40

3-2- استرپتومایسس ها…………………………………………………………………………………………………. 43

3-2-1- پاتولوژی………………………………………………………………………………………………………… 43

3-2-2 – مرفولوژی و ساختمان………………………………………………………………………………………. 43

3-2-3- مشخصات کلنی……………………………………………………………………………………………… 454

3-2-4- اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………….. 47

3-2-5- ترکیبات پوشش سلولی………………………………………………………………………………………. 49

3-2-6- تغذیه و فاکتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیکوشیمیایی…………………………………….. 49

3-2-6-1- تغذیه…………………………………………………………………………………………………………. 49

3-2-6-2- اکسیژن……………………………………………………………………………………………………….. 50

3-2-6-3 – رطوبت50

3-2-6-4- دما51

3-2-6-5- pH51

3-2-6-6- اکولوژی52

3-2-6-7- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس53

3-2-7- انواع فرآورده های میکروبی56

3-2-7-1- متابولیت های اولیه56

3-2-7-2- متابولیت های ثانویه56

3-2-7-2-1- آنتی بیوتیک ها58

3-2-7-2-1-1- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیک58

3-2-7-3- آنزیمها63

3-2-7-3-1- پروتئازها63

3-2-7-3-1-1- پروتئازهای اسیدی67

3-2-7-3-1-1-1- رنین67

3-2-7-3-1-2- پروتئازهای خنثی67

3-2-7-3-1-3- پروتئاز های قلیایی67

3-2-7-3-1-3-1- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی68

3-2-7-3-1-3-2- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی69

3-2-7-3-1-4- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها69

3-2-7-3-1-5- تجزیه71

3-2-7-3-1-6- پروتئاز ها و استرپتومایسسها71

3-2-8- محیط کشت  تخمیر صنعتی71

3-2-8-1- نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها71

3-2-8-1-1- کربن74

3-2-8-1-1-1- منابع کربن و استرپتومایسس ها77

3-2-8-1-2-نیتروژن78

3-2-8-1-2-1-  منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها80

3-2-8-1-3- هیدروژن و اکسیژن80

3-2-8-1-4- مواد معدنی80

3-2-8-2-تنظیم کننده های متابولیکی81

3-2-8-3- ضد کف ها82

3-2-9- بیوسنتز  در استرپتومایسس ها83

فصل چهارم

4-1- دستگاه های مورد استفاده86

4-2- وسایل مورد استفاده86

4-3 – محیط های کشت مایع برای رشد باکتری88

4-4- محیط های کشت جامد برای رشد باکتری89

4-5- محیط های جامد برای تولید اسپور89

4-6- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم90

4-7- مواد لازم جهت استفاده از میکروسکوپ نوری91

4-8- محیط مورد استفاده جهت شناسایی کیفی دسفری اکسامین: محیط Des₄91

4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اکسامین محیط Soy bean ………………. 91

4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باکتری ها92

4-11- معرف های دسفری اکسامین92

4-12- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اکسامین B92

4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اکسامین92

4-14- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer93

4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl93

4-15- محلول کازئین %5/0 دربافر فسفات93

4-15-1- بافر فسفات (PBS93

4-16- محلول لوری (Lowry93

فصل پنجم

5 – 1- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس98

5 ـ 2 ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی سویه استرپتومایسس پیلوسوس98

5-2-1- خصوصیات ماکروسکوپی99

5- 2-1-1- کشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد99

5-2-1-2- کشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع99

5-2-2 خصوصیات میکروسکوپی99

5-2-2-1- تهیه لام از محیط کشت جامد99

5-2-2-2- تهیه لام از محیط کشت مایع100

5ـ 2ـ2ـ 3ـ رنگ آمیزی گرم100

5 ـ 3ـ تهیه مایع تلقیح100

5 ـ 3ـ 1ـ تهیه محیط ذخیره101

5 ـ 3ـ 2ـ تهیه سوسپانسیون اسپور101

5ـ 4ـ رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس101

5ـ 5ـ بررسی تغییرات  pH در محیط کشت Soybean…………………………………………………….. 102

5ـ 6ـ تولید دسفری اکسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس102

5ـ 6ـ 1ـ تشخیص کیفی دسفری اکسامین102

5ـ 6ـ 2ـ سنجش میزان تولید دسفری اکسامین در هر روز103

5-6-3- رسم منحنی استاندارد دسفرال103

5-7ـ استخراج دسفری اکسامین بوسیله فنل-کلروفرم104

 5 ـ 7ـ 1ـ مزتیله کردن دسفری اکسامین105

5-8- تعیین وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده105

5ـ 9ـ  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین107

5ـ 9ـ 1ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین107

5 ـ 9ـ 1ـ 1ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت………… 107

5ـ 9ـ 2ـ بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB₁)  ( برتولید دسفری اکسامین 108

5 ـ 9ـ 3ـ بررسی گلوکز و ملاس و سوکروز بر تولید دسفری اکسامین……………………………………. 108

5ـ 9ـ 4ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر تولید دسفری اکسامین…………………………………….. 108

5 ـ 9ـ 5ـ  استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean……….. 109

5 ـ 9ـ 6ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………. 109

5 ـ9ـ6ـ1ـ بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین………….. 111

5 ـ 10 – بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته  کننده ها و مواد معدنی مختلف        112

5 ـ 10ـ 1ـ کشت باکتری و سنجش پروتئاز112

5 ـ 10ـ 2ـ تخلیص کازئین113

فصل ششم

6ـ 1ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی ماکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس115

6ـ 1ـ 1­ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد بر روی محیط کشت جامد115

6 ـ 1ـ2ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد در محیط کشت مایع…………………………………. 115

6 ـ 2ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی میکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس………………………… 116

6 ـ3ـ رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط کشت MYB……………………………….. 116

6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط کشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس…. 118

6 ـ 5ـ تشخیص کیفی و کمی دسفری اکسامین تولیدی………………………………………………………… 120

6-5-1- تشخیص کیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اکسامین……………………………………………. 120

6ـ5ـ2ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال……………………………………………………………………………… 120

6ـ5ـ3ـ میزان دسفری اکسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean……………………………………………………………………………………………………………………………… 121

6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اکسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس…… 122

6-6-1- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده………………………….. 122

6-7-  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین………………………………………………………… 124

6-7-1  بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین……………………………………………… 124

6-7-1-1- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت…………… 124

6ـ7ـ 2ـ بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B₁ )…………………………….. 126

6 ـ 7ـ3ـ بررسی گلوکز ، ملاس، سوکروز بر تولید دسفری اکسامین………………………………………… 126

6ـ 7ـ 4ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………….. 127

6ـ 7ـ 5ـ استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean………….. 128

6 ـ 7ـ 6ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………. 128

6 – 7 – 6 – 1 – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اکسامین ……….. 130